Inhibarea factorului de transcripție CREB1 prin peptide ciclice: o abordare inovatoare pentru proteinele greu de țintit terapeutic

Un studiu realizat la Universitatea din Bath și publicat în jurnalul Cell Chemical Biology a prezentat o metodă inovatoare pentru descoperirea rapidă de peptide ciclice capabile să inhibe factori de transcripție implicați în cancer. Cercetarea introduce o platformă experimentală numită intracellular cyclization transcription block survival (icTBS), care permite generarea și selecția directă, în interiorul celulelor bacteriene, a peptidelor ciclice cu activitate biologică. Rezultatele arată că această tehnologie poate identifica inhibitori puternici ai factorului de transcripție CREB1, capabili să reducă viabilitatea celulelor de melanom și cancer colorectal.

Idei principale

• Peptidele ciclice sunt considerate o clasă promițătoare de molecule terapeutice datorită stabilității și afinității crescute pentru țintele moleculare.
• Noua platformă icTBS permite ciclizarea peptidelor direct în celule bacteriene în timpul screeningului.
• Metoda combină evoluția secvenței peptidei cu optimizarea poziției legăturilor de ciclizare.
• Au fost identificați inhibitori ciclici ai factorului de transcripție CREB1 cu afinitate de până la 41 nM.
• Peptida optimizată a blocat interacțiunea CREB1 cu ADN-ul și a redus viabilitatea celulelor tumorale.
• Rezultatele sugerează o strategie generală pentru dezvoltarea de medicamente împotriva proteinelor considerate dificil de țintit farmacologic.

Context

Peptidele terapeutice au devenit o clasă importantă de molecule biologic active datorită progreselor în sinteza chimică și în tehnologiile de screening bazate pe biblioteci genetice. Spre deosebire de moleculele mici, peptidele pot recunoaște suprafețe proteice extinse și complexe, ceea ce le face potrivite pentru ținte considerate dificil de inhibat prin metode convenționale.

Un element esențial în optimizarea peptidelor terapeutice este ciclizarea, proces prin care capetele sau lanțurile laterale ale peptidei sunt legate covalent pentru a restricționa conformația moleculară. Această constrângere structurală poate:

• crește afinitatea pentru ținta moleculară
• îmbunătăți stabilitatea metabolică
• facilita pătrunderea în celule

Factorii de transcripție reprezintă o categorie importantă de ținte terapeutice, însă multe dintre aceste proteine sunt considerate „greu de țintit terapeutic”, deoarece interacțiunile lor cu ADN-ul implică suprafețe extinse și dinamice. Un exemplu relevant este CREB1, un factor de transcripție implicat în reglarea a mii de gene și asociat cu progresia mai multor tipuri de cancer, inclusiv melanomul și cancerul colorectal.

Despre studiu

Principiul platformei icTBS

Platforma icTBS reprezintă o evoluție a metodei transcription block survival (TBS), care identifică peptide capabile să inhibe interacțiunile dintre proteine și ADN în interiorul celulelor bacteriene.

În acest sistem:

• genele bacteriene esențiale sunt modificate pentru a conține secvențe de ADN recunoscute de factorul de transcripție țintă
• legarea proteinei de aceste secvențe blochează transcripția și oprește creșterea bacteriilor
• peptidele care inhibă interacțiunea proteină–ADN restabilesc expresia genei și permit proliferarea bacteriană

Prin urmare, supraviețuirea bacteriilor devine un indicator direct al activității inhibitorii a peptidei.

Ciclizarea peptidelor în interiorul celulelor

Pentru a introduce constrângeri structurale direct în timpul screeningului, cercetătorii au utilizat compuși chimici capabili să formeze legături între două reziduuri de cisteină din peptidă. Acești compuși bis-alchilanți au fost adăugați direct în mediul de cultură bacterian.

Un panel de 11 compuși de crosslinking a fost testat pentru a evalua:

• capacitatea de a pătrunde în celulele bacteriene
• reactivitatea cu reziduurile de cisteină
• toxicitatea asupra celulelor

Dintre aceștia, șapte compuși au produs ciclizarea eficientă a peptidelor în interiorul bacteriilor, cu rate de conversie de până la 98% peptide ciclizate.

Bibliotecile de peptide analizate

Cercetătorii au construit două tipuri de biblioteci genetice:

• o bibliotecă de peptide liniare cu diversitate teoretică de aproximativ 11,3 milioane secvențe
• o bibliotecă de peptide ciclizabile cu diversitate teoretică de aproximativ 63 milioane variante

În bibliotecile ciclice au fost introduse perechi de cisteine pentru a permite formarea de legături intramoleculare și generarea diferitelor geometrii structurale.

Rezultate

Identificarea inhibitorilor CREB1

Screeningul bibliotecilor a identificat trei peptide principale capabile să inhibe interacțiunea dintre CREB1 și secvența sa țintă de ADN.

Analizele biofizice au arătat că peptidele ciclice au avut afinități superioare comparativ cu variantele liniare.

• afinitate maximă: 41 ± 7 nM
• peptida liniară optimizată: 89 ± 18 nM
• peptida parentală A-CREB: 230 ± 36 nM

Astfel, optimizarea simultană a secvenței și a poziției ciclizării a crescut afinitatea de legare de peste 5 ori.

Inhibarea interacțiunii proteină–ADN

Testele de polarizare fluorescentă au demonstrat că peptidele descoperite pot bloca interacțiunea CREB1 cu ADN-ul. Cea mai eficientă peptidă a prezentat:

• IC50 pentru inhibarea complexului CREB1–ADN: 247 ± 46 nM

Peptida a demonstrat selectivitate față de factori de transcripție similari din familia bZIP, precum ATF2 sau cJun.

Activitate în celule tumorale

Pentru a evalua activitatea biologică, inhibitorul optim a fost modificat prin atașarea unei secvențe peptide capabile să faciliteze pătrunderea în celule.

Varianta optimizată a peptidei a demonstrat efecte semnificative în două linii celulare tumorale:

• melanom uman A375
• cancer colorectal HCT116

În celulele A375, peptida a redus viabilitatea celulară cu un IC50 de aproximativ 5,7 μM după 72 de ore de tratament.

Blocarea activității oncogene a CREB1

Experimentele moleculare au confirmat mecanismul de acțiune al peptidei:

• reducerea activării genelor dependente de CREB
• scăderea expresiei genelor oncogene precum KPNA2 și ACOT7
• creșterea activității caspazelor 3 și 7, indicând inducerea apoptozei

Nivelul total al proteinei CREB1 nu a fost modificat, sugerând că peptida inhibă funcția factorului de transcripție fără a-i afecta expresia.

Concluzii

Studiul demonstrează că platforma icTBS permite descoperirea rapidă de peptide ciclice capabile să inhibe interacțiunile dintre factori de transcripție și ADN. Prin integrarea ciclizării peptidelor direct în procesul de selecție biologică, metoda permite optimizarea simultană a secvenței peptidei și a geometriei constrângerii structurale.

Aplicarea acestei tehnologii a condus la identificarea unor inhibitori eficienți ai factorului de transcripție CREB1, care reduc activitatea oncogenă și viabilitatea celulelor tumorale. Rezultatele sugerează că această strategie ar putea deschide noi direcții pentru dezvoltarea de terapii împotriva proteinelor considerate anterior dificil de țintit farmacologic.